注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

原理是由一對引物介導(dǎo)，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過n個熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝倍，使得檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
 特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；
?
實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

蛋白胨水 (靛基質(zhì)培養(yǎng)基) 規(guī)格： 100g 用途： 供鑒別細(xì)菌能否產(chǎn)生靛基質(zhì)的生化反應(yīng)

TT(人甲狀腺導(dǎo)管細(xì)胞)釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

克氏檸檬酸培養(yǎng)基/Christensen Citrate Medium腸桿菌鑒別250克國產(chǎn)/進(jìn)口

堿性瓊脂平板/Alkaline Agar用于分離霍亂弧菌250克國產(chǎn)/進(jìn)口

Endogenous Enzymes Blocking Buffer/內(nèi)源性過氧化物酶封閉10ml

七號膽/7號膽/膽7號/膽酸-脫氧膽混合物/Bile salt No.7BR25克國產(chǎn)/進(jìn)口

OVCAR-3(人卵巢細(xì)胞)5×106cells/瓶×2

小鼠肺大靜脈內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基LLC-MK2(恒河猴腎細(xì)胞)

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

敘利亞倉鼠腎細(xì)胞英文名稱：BHK-21

瘤菌 Rhizobium sp.

氣腫疽梭狀芽孢桿菌PCR檢測試劑盒規(guī)格4--3-硝吡  139.11  4- amino -3- nitro pyridine*：1681-37-4分子量： C5H5N3O2

祖師麻甲素(瑞香素）  Founder Ma Jiasu (daphnetin)  178.144分子量：C9H6O4*：486-35-1

莫西克汀  Moshe Curtin  639.82分子量： C37H53NO8*：507-06-5

芽孢染色  Spore staining solution  分子量：*：67ykh

乙  60.1  Ethyl hydrazine*：624-80-6分子量： C2H8N2

1-脫氧野尻霉素  1- deoxynojirimycin  163.17172分子量：C6H13NO4*：19130-96-2

1-甲-3-甲酸甲酯  157.21  1- methyl -3- methyl piperidine*：1690-72-8分子量： C8H15NO2

5--3-溴-2-氯吡  207.46  5- amino -3- -2-*：130284-53-6分子量： C5H4BrClN2

2,3-雙(3-氟)-5-氯四氮唑  370.79  2,3- (double 3- difluorophenyl) -5- 5-triphenyl tetrazolium chloride*：zx8分子量： C19H13ClF2N4

1-甲-5-(三正丁錫)咪唑  371.15  1- methyl -5- (tributylstannyl) imidazole*：147716-03-8分子量： C16H32N2Sn

1-溴-3-n-己    1- -3-n- cyclohexyl benzene bromide*：38409-59-5分子量： C12H17Br

技術(shù)原理：
 DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。
       在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）
       發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。